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생태독성 통합관리제도는 기존 개별 화학물질에 의한 수질평가의 한계를 극복하기위해 도입하고자 하는 생물을 이용한 산업수 수질평가 방법입니다. 평가는 미지의 물질이나 혼합물로 인한 독성영향을 알아보기 위해 생물을 이용하여 실험하는 방법으로 시험종으로 사용되는 생물은 박테리아, 조류, 물벼룩, 어류 등이 있습니다. 본 영상물에서는 우리나라에서 2011년부터 적용하게 될 물벼룩에 의한 급성독성시험방법과 동 기준을 초과할 경우 수행되어야 하는 원인물질탐색 방법에 대해 소개하고자 합니다.

Part 1. 생태독성 급성 시험 방법

생태독성 시험은 크게 급성평가와 만성평가로 구분하게 되는 데 본 영상물에서는 수질오염공정시험법에 고시된 24시간 동안의 급성독성시험방법에 대해 소개하고자 합니다. 시험법에 대한 주요 내용은 먹이로 사용되고 있는 식물플랑크톤 배양방법, 시험생물소개, 물벼룩 먹이공급 및 배양방법, 그리고 자료처리 방법 등으로 구성되어 있습니다.

물벼룩이란?

화학물질의 수서무척추동물 독성연구에 국제 표준종으로 사용되는 Daphnia magna는 독성물질에 대한 감수성이 타 종에 비해 높고 방대한 독성자료를 가지고 있으며 실내 사육이 매우 쉽다는 장점을 가지고 있습니다. 일반적으로 암컷의 평균 체장은 5~6 mm이며, 20℃에서 약 7~9일 정도면 새끼를 낳기 시작합니다. 환경조건이 양호할 때 30마리 이상 낳기도 합니다. 수명은 약 40일 정도입니다.

1. 1) 시료 처리

   시료는 도착한 다음 바로 시험을 실시할 수 있도록 준비되어야 하며 시료 채수 24시간 이내에 가능한 시험을 시작하는 것이 좋습니다. 또한, 시료처리시간은 최대 72시간을 초과하지 않도록 하여야 합니다. 시료는 냉장상태로 운반되어야 하며 도착 시료에 대한 정보를 작성하고 분석 전까지 냉장보관(4oC이하)을 하고, 시료채취 후 36시간 이내에 독성시험을 실시하여야 합니다.

2. 2) 희석수 준비

   시험 성공을 위해 중요한 요인 중의 하나로 희석수로 사용할 물을 선택하는 것입니다. 모든 지표수가 사용될 수 있는 것은 아니며 배양조건을 충족하기 위해서 배양액속의 10마리 이상 어미개체에서 매 일주일당 어린 개체 생산력을 측정하여 결정되어야 합니다. 인공적으로 조제된 물은 초순수로 조제하고 탈 이온수나 탄소 여과된 물을 사용하는 것이 중요합니다. 또한 어떠한 물을 사용하던지 간에 마지막에는 bacterial filter를 사용하여 여과하고 물은 14일 이상 저장하여 사용하면 안 됩니다. 희석수의 제조 시 염화칼륨, 황산마그네슘, 황산칼슘 이수화물, 탄산수소나트륨을 첨가하고, 사용하기 전에 24시간 이상 폭기 시켜 시약이 충분히 용해되도록 합니다.

3. 3) 시험생물

   동일한 민감성을 가진 물벼룩을 생산하기 위해서는 시험 3주전에 독성물질에 노출되지 않은 어미 물벼룩으로부터 개별배양을 실시하여 2-3세대의 어미 물벼룩을 생산해야 합니다. 이 방법을 물벼룩의 순화라고 합니다. 이러한 순화과정을 통해 개별적으로 배양한 생후 2주이상의 모체 중 3회 이상의 생산경험이 있고 8마리 이상의 신생개체를 낳은 모체로부터 얻어진 생후 24시간 미만의 어린 개체를 선별하여 최종적으로 시험에 사용하게 되는 것입니다.

4. 4) 식물플랑크톤 배양

   어미 물벼룩 먹이는 매일 하루정도 먹을 수 있는 양, 녹조류의 경우 2L 당 60-70 mL 정도를 주입합니다. 먹이 식물플랑크톤은 Selenastrum sp.(실레나스트럼 에스피)나 Chlorella sp.(클로렐라 에스피)와 같은 단세포 녹조류를 사용합니다. 만약, 먹이양이 많을 경우 물벼룩의 몸에 조류가 달라붙어서 물벼룩 성장에 방해를 가져올 수 있으며, 심한 경우 사망에 이를 수도 있기 때문에 주의해야 합니다.

5. 5) 물벼룩 먹이 공급

   시험생물에게는 배양액에 제공하는 것과 동일한 먹이를 매일 공급해야 합니다. 기존에는 식물플랑크톤만을 제공하였지만 부족한 영양분을 보충하기 위해 yeast, cereal leaves, trout food로 만들어진 YCT를 추가로 공급할 수도 있습니다. 시험액 15 mL당 조류세포 수는 약 2-2.8×105 cell 정도가 되어야 합니다. 또한, 교체 시 증발을 예방하고 시험실내 오염을 가능한 차단하기 위해 시험용기의 마개를 꼭 덮어야 합니다.

6. 6) 물벼룩 24시간 급성독성평가 방법

   시험방법은 시험기간 중 시험용액을 교환하지 않는 지수식 시험방법으로 수행하고 표준지표독성시험으로 시험값의 신뢰도를 확인한 다음 24시간이 경과된 후 반수영향농도 즉 EC50 값을 측정합니다. 최종적으로는 독성값의 이해를 높이기 위해 도입된 독성단위(Toxic Unit)를 사용하여 EC50값을 100으로 나누어 최종 독성값으로 결정하게 됩니다. 즉, 독성단위값이 높으면 높을수록 생태독성값이 높다는 뜻이 됩니다. 물벼룩 급성독성평가 과정을 보면 먼저 시료를 대조구(시험수), 폐수 100%, 폐수 50%, 폐수 25%, 폐수 12.5%, 폐수 6.25%의 농도로 각각 네 개의 반복구로 준비합니다. 그 다음 성체로부터 생산된 24시간 미만의 어린 개체를 희석된 시료에 각각 5마리씩 투입한 후 20oC 항온 배양기에서 24시간 노출배양을 실시합니다. 24시간이 지난 후 시험용기를 꺼내 조용히 움직여 준 후 약 15초 간 개체의 상태와 일부기관을 해부 현미경으로 관찰합니다. 15초간 관찰할 때 자유롭게 유영하거나 움직임이 활발할 때를 ‘생존’이라 판정합니다. 촉각, 후복부, 심장 등의 움직임은 있으나 매우 미약하여 유영할 수 없는 상태를 ‘유영저해’라고 판정합니다. 심장, 촉각 등의 움직임이 완전히 없는 상태는 ‘사망’이라 판정합니다. 사망했거나 유영저해 상태에 있는 개체를 개수하여 유영저해율로 표현합니다.

Part 2. 독성 원인물질 탐색방법

생태독성 배출허용기준을 초과하게 되면 사업장은 독성원인물질탐색과 독성저감방안을 마련하여야 합니다. 먼저 독성원인물질탐색은 크게 3가지 단계로 구성되어 있는 데 1단계는 원인물질을 크게 그룹으로 특성화하는 과정입니다. 특성화방법에는 크게 부유물테스트, 중금속테스트, 암모니아테스트, 유기화합물테스트, 산화제테스트, 휘발성테스트의 6가지 방법으로 구성되어 있습니다.

Tier 1

독성원인물질탐색 첫 단계는 시료 독성이 존재하는지 여부를 평가하기 위한 초기 독성 테스트(Initial toxicity test)에서 시작합니다. 초기 독성 테스트에서 독성이 있는 것으로 판명되면, 시료에 다양한 처리를 한 후, 각각의 처리 이전과 이후의 시료를 이용하여 독성실험을 실시하고 그 결과를 종합하여 독성의 원인 물질 군이 무엇인지를 판정하게 됩니다.

1. 1) 부유물질 테스트

   시료 내 입자상으로 존재하는 독성물질의 영향을 알아보기 위한 과정으로 시료를 물리적으로 여과시킨 것과 여과시키지 않은 것을 준비하여 물리적으로 여과된 이후 독성이 감소하는 지 여부를 확인하는 과정입니다. 만일 여과시킨 시료에서 독성이 감소한다면 부유물이 독성의 원인물질 그룹이라 판단할 수 있습니다. 시료는 GF/C 여과지로 통과시킨 후 부유물이 제거된 시료를 이용하여 독성 실험을 실시하게 됩니다.

2. 2) 유기화합물 테스트

   독성을 갖는 비극성 유기화합물의 영향을 알아보기 위한 과정으로, 비극성유기화합물을 흡착시키는 C18(octadecyl) 칼럼에 시료를 통과시킨 후 독성이 감소되었는지 여부를 확인합니다. 시험방법은 Sep-Pak C18 SPE (Solid Phase Extraction) column에 시료를 연동 펌프를 이용하여 10 mL/min의 속도로 통과시킨 후, 비극성 유기화합물이 제거된 시료를 이용하여 독성 실험을 실시하게 됩니다.

3. 3) 휘발성물질 테스트

   시료 내 휘발성 물질의 영향을 알아보기 위한 과정으로, 시료를 물리적으로 폭기시킨 것과 폭기시키지 않은 것을 준비하여 물리적으로 폭기 처리된 이후 독성이 감소하는지 여부를 확인하는 과정입니다. 만일 폭기시킨 것에서 독성이 감소한다면 휘발성물질들이 독성의 원인물질 그룹이라 판단할 수 있습니다. 시험방법은 시료에 유리재질의 pasteur pipette을 통하여 2시간 동안 기포를 발생시켜 휘발성 물질을 제거한 후 독성 실험을 실시하고 이때 공기 주입관 중간에는 in-lime filter를 이용하여 공기 중의 입자가 시료에 들어가지 않도록 실시하게 됩니다.

4. 4) 중금속 테스트

   시료에 중금속과 착화합물을 형성하는 EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)를 주입하여 중금속 독성을 제거하는 과정입니다. 시료에 중금속과 착화합물을 형성하는 EDTA를 처리한 것과 처리하지 않은 것을 준비하여 EDTA 처리 이후 독성이 감소하는지 여부를 확인하는 과정이다. 만일 EDTA 처리시킨 것에서 독성이 감소한다면 중금속류가 독성의 원인물질 그룹이라 판단할 수 있습니다. 시험방법은 시료에 중금속과 착염을 형성하는 킬레이트인 EDTA를 30 mg/L 가 되도록 주입하고, 24시간 이상 반응시켜 중금속의 독성을 제거한 후 독성 실험을 실시하게 됩니다.

5. 5) 산화제 테스트

   시료에 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate)를 주입하여 산화제(특히 염소)의 독성을 판정하는 시험으로 시료에 티오황산나트륨을 처리한 것과 처리하지 않은 것을 테스트하여 티오황산나트륨 처리한 것에서 독성이 감소하는 지 여부를 확인하는 과정입니다. 만일 티오황산나트륨 처리구에서 독성이 감소한다면 산화성 물질이 독성의 원인물질 그룹이라 판단할 수 있습니다. 또한, 티오황산나트륨은 중금속 중 일부와 결합하여 독성을 감소시키기도 하므로 EDTA 실험 결과와 함께 분석이 필요한 과정으로 시험방법은 시료에 티오황산나트륨(Na2S2O7)을 500 mg/L가 되도록 주입하고, 24시간 이상 반응시켜 산화제를 제거한 후 독성실험을 실시하게 됩니다.

6. 6) 암모니아 테스트

   시료의 pH를 여러 단계로 변화시켜 독성실험을 실시하는 것으로, pH 조건에 따라 독성이 달라지는 화합물 특히 암모니아의 독성 유무를 확인할 때 이용됩니다. 암모니아는 pH가 증가하면서 독성도 증가하게 됩니다. 그러므로 pH가 감소함에 따라 독성 또한 감소할 경우, 독성에 기여하는 암모니아의 역할이 크다고 볼 수 있고 시험방법은 시료의 pH가 6, 7, 8이 되도록 각각 준비하여 암모니아와 암모늄 이온의 상대적 비율을 달리 조절하여 각 시료별로 독성실험을 실시하게 됩니다.

독성원인물질을 탐색하는 과정은 총 3단계로 구성되어 있습니다. 먼저 1단계는 특성화하는 과정, 2단계는 독성원인물질을 화학분석 등을 통해 확인하는 과정이며 마지막 단계는 확증하는 단계입니다. 미국의 경우에도 독성원인물질 탐색 성공률은 90%에 육박하고 있으며 원인물질을 확인한 다음에 최종적으로 가장 비용 효과적이고 실제적인 독성저감방법을 선택하여 독성저감을 실시하게 됩니다.

생태독성 관리제도는 보다 더 건강한 수환경을 조성하고자 하는 우리의 노력입니다. 이 제도가 조기에 정착될 수 있도록 관계자분들의 많은 협조를 부탁드립니다.